Tenascin C促进神经胶质瘤细胞恶性行为,抑制化学敏感性紫杉醇通过PI3K / AKT信号通路的激活

本研究旨在检测tenascin C (TNC)的影响细胞的功能和化学敏感性紫杉醇磷脂酰肌醇3-kinase /蛋白激酶B (PI3K / AKT信号在神经胶质瘤细胞)。

人类神经胶质瘤细胞U87 ln - 229, T98G U251和正常的人类得到了星形胶质细胞,过渡委员会表达检测。U87细胞和U251细胞的选择和慢病毒感染控制过度,过渡委员会进行靶向治疗,控制击倒,过渡委员会击倒功能实验。救援实验被进行评估的影响PI3K / AKT激活740 y p细胞功能和化学敏感性紫杉醇TNC击倒U251细胞。过渡委员会mRNA和蛋白表达在神经胶质瘤细胞升高,包括U87、ln - 229, U251和T98G细胞,而正常的人类星形胶质细胞。U87 U251细胞,过渡委员会推广扩散而抑制细胞凋亡。此外,过渡委员会调节PI3K和p-AKT U87和U251细胞蛋白表达。至于化学敏感性,过渡委员会增加相对可行性U251细胞接受400 ng / mL和800 ng / mL紫杉醇。具备干细胞,过渡委员会增加了球数量每1000个细胞CD44⁺CD133⁺细胞百分比和1 /干细胞频率(评估极端限制稀释分析)U251细胞。在救援的实验中,740 y p降低了过渡委员会对扩散的影响,细胞凋亡,紫杉醇化学敏感性,具备干细胞在U251细胞。

过渡委员会作为一个致癌因素通过促进肿瘤细胞增殖和具备干细胞而抑制凋亡和化学敏感性紫杉醇通过调制PI3K / AKT信号在神经胶质瘤。

Tenascin C (TNC)的糖蛋白multi-modular结构主要表达在肌腱和胚胎,胚胎发育的一个至关重要的监管机构,主要是通过与能动的细胞(Brosicke和Faissner交互2015年)。过渡委员会在人体内的分布的研究是一个有趣的话题。过渡委员会表示在非常低的水平在成人组织的胚胎相比,尽管它是表达最丰富的干细胞,网站的炎症或组织创伤,和成人实体肿瘤(Uenishi et al。2014年;宁等。2019年;赵等。2017年;Leppanen et al。2019年)。基于它的作用在调节细胞粘附与纤连蛋白绑定在组织再生,越来越多的基础和临床科学家们将注意力转向过渡委员会在肿瘤的潜在价值(Giuffrida et al。2004年;Sundquist et al。2017年)。首次发现以来,关于过渡委员会在癌症的作用,二十年过去了。发现如过渡委员会参与肿瘤的生长、转移和具备干细胞活力肿瘤学的研究领域(太阳et al。2018年;太阳等。2019年;杨et al。2019年)。

脑胶质瘤是最常见的诊断癌症;然而,与其他实体肿瘤相比,它提供了与极低的患病率大约6每100000人,仍为一个巨大的全球死亡率(Dolecek et al。2012年)。来自神经胶质前体细胞,神经胶质瘤不仅是一种癌还脑疾病;因此病人通常遭受许多神经系统症状,如头痛和癫痫(田中et al。2013年)。尽管各种方法治疗神经胶质瘤包括切除,化疗和放疗,尽管化疗的结合、甲基苄肼已经发现延长生存,神经胶质瘤患者的生存资料仍然是最贫穷的国家之一(Buckner et al。2014年;钟等。2020年)。一项研究报道,TNC超表达与儿童脑干神经胶质瘤表型和更不满意生存概要(Qi et al。2019年)。一些研究也揭示了过渡委员会之间的相关性和神经胶质瘤病因;然而,精确的理解监管功能和底层机制过渡委员会神经胶质瘤仍然遥遥无期。

因此,我们旨在确定过渡委员会对癌症细胞功能的影响,化学敏感性紫杉醇和PI3K / AKT信号在神经胶质瘤。

细胞培养和试剂

人类神经胶质瘤细胞U87 ln - 229, T98G和U251从美国购买类型文化集合(美国写明ATCC)或欧洲认证收集细胞培养(英国ECACC),和培养供应商推荐的媒介。正常人类的星形胶质细胞,从Lonza购买(瑞士),在星形胶质细胞培养基培养(美国细胞应用程序)。试剂盒™试剂,PrimeScript™RT绿色实时PCR试剂盒和结核病混合了从热费希尔科学大师,Inc .(美国)和豆类生物医学科技(北京)有限公司有限公司(中国),分别。里帕裂解缓冲是来自默克Sigma-Aldrich(美国)。BCA蛋白质分析工具包提供了Beyotime生物技术研究所(中国)。预制凝胶(4 - 20%)是获得能够带生物科技有限公司(中国)。硝化纤维素滤膜是来自默克密理博(达姆施塔特,德国)。皮尔斯™ECL +免疫印迹基质是购自热费希尔科学公司(美国)。细胞计数kit-8和膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备是获得Dojindo分子技术,Inc .(日本)和默克Sigma-Aldrich,分别(美国)。紫杉醇和PI3K激活740 y p从Sangon购买生物科技(上海)有限公司,有限公司(中国)和塞莱克化学品(美国)。 B-27™ Supplement, recombinant human epidermal growth factor (EGF), recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) and Dulbecco's modified Eagle medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) were purchased from Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA). PI3 kinase p110α rabbit polyclonal antibody (1:1000), AKT rabbit polyclonal antibody (1:1000) and phospho-Akt rabbit polyclonal antibody (1:1000) were purchased from Cell Signaling Technology, Inc. (CST, UK). Tenascin-C rabbit polyclonal antibody (1:1000), GAPDH rabbit monoclonal antibody (1:5000) and HRP-labeled goat anti-rabbit IgG(H+L) (1:3000) were purchased from Abcam plc (UK). PE-labeled CD133 antibody and APC-labeled CD44 antibody were purchased from Becton, Dickinson and Company (USA). Lentivirus for overexpression of TNC (OE-TNC) and overexpression-negative control (OE-NC), which were constructed with a pLV-CMVIE-RFP-T2A-Puro vector, enveloped in a pMD2.G vector and psPAX2 vector, were completed by Hanbio Biotechlogy Co., Ltd. (China). Lentivirus for knockdown TNC (KD-TNC) and knockdown negative control (KD-NC), which were constructed with the pLV-U6-RFP-T2A-luc vector, were enveloped with pMD2.G vector and psPAX2 vector by Hanbio Biotechlogy Co., Ltd. (China). Polybrene and puromycin were provided by Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (China). TNC primers (forward: 5′ AATGAGATGCGGGTCACAGA 3′, reverse: 5′ GATGGCAAATACACGGATAAAGT 3′) and GAPDH primers (forward: 5′ GACCACAGTCCATGCCATCAC 3′, reverse: 5′ ACGCCTGCTTCACCACCTT 3′) were synthesized by Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (China).

慢病毒感染

U251, U87细胞感染OE-NC OE-TNC, KD-NC KD-TNC慢病毒与感染复数(MOI) 24小时的20 6μg /毫升聚凝胺的存在。细胞培养48 h后,他们收集RT-qPCR和免疫印迹检测过渡委员会表达式。然后细胞培养2μg /毫升嘌呤霉素筛选7天的稳定感染细胞。PI3K的表达,一种蛋白激酶和p-AKT被免疫印迹检测。

细胞增殖和细胞凋亡

的增殖和凋亡稳定感染U251 U87细胞进行评估和细胞计数kit-8膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备,分别。的指令来完成检测、包被严格遵守。

药物化学敏感性

稳定感染U251细胞被播种在96 -孔板24 h后的细胞培养介质包含0,100,200,400,800和1600 ng / ml紫杉醇为另一个24 h。细胞生存能力评估使用细胞计数kit-8,与细胞培养0 ng / ml紫杉醇设置为100%。

球体形成分析和极端限制稀释分析(ELDA)

集合后,1000稳定感染U251细胞培养与球体形成媒介DMEM / F12含有2% B-27™补充,20 ng / ml bFGF和7天20 ng / ml EGF,球体的数量和直径> 50μm统计。ELDA,稳定感染U251细胞数量为1000,100都镀24井和培养与球体形成媒介7天。井与至少一个球直径> 50μm数,和数据计算与ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)。

CD44阳性的和CD133-Positive (CD44⁺CD133⁺)细胞评估

稳定感染U251细胞收集和resuspended。然后APC-labeled CD44抗体(1:50)和PE-labeled CD133抗体(1:50)孵化与细胞在黑暗中在冰上30分钟。最后,细胞用流式细胞分析仪检测(美国BD)和CD44的百分比⁺CD133⁺分析了细胞与FlowJo 7.6(美国BD)。

740 y p治疗

治疗740 y p,包含740 y pμM准备培养基。然后稳定感染U251细胞孵化740 y p,其次是PI3K, AKT和p-AKT表达检测、细胞增殖和细胞凋亡评估、药物化学敏感性评价,球体形成试验和ELDA检测和CD44⁺CD133⁺细胞评估使用上面描述的方法。

定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

提取的总RNA在细胞与试剂盒™试剂、逆转录和qPCR后进行使用PrimeScript™RT绿色实时PCR试剂盒和结核病掌握混合。过渡委员会的表达(GAPDH作为内部参考)计算使用2^−ΔΔCt方法。

免疫印迹

细胞是细胞溶解,总蛋白提取与里帕裂解缓冲。然后BCA蛋白质分析工具被用来量化蛋白质的浓度。热变性后,20μg蛋白质被装载在预制凝胶和分离的4 - 20%。蛋白质被转移到一个硝基过滤膜,其次是孵化主要抗体。与二次孵化后抗体,蛋白质带与皮尔斯可视化™ECL +免疫印迹基质。

统计分析

数据分析和图表绘制进行了GraphPad Prism 7.02软件(GraphPad软件有限公司、美国)。所有数据提出了均值±标准差。比较组间是由单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett多个比较测试或图基的多个比较测试。直接比较两组之间的决定t测试。P< 0.05被认为是具有统计学意义。P< 0.05、< 0.01和< 0.001表示为*,* *,* * *,分别。非重要结果标记为NS。

过渡委员会在人类神经胶质瘤细胞调节

过渡委员会mRNA在人神经胶质瘤细胞,包括U87 (P< 0.001),ln - 229 (P< 0.001),U251 (P< 0.01)和T98G (P< 0.001)细胞,正常的人类相比星形胶质细胞(图1),过渡委员会在U87蛋白表达也调节,ln - 229, U251 T89G细胞相比,正常的人类星形胶质细胞(图。1b)。U251细胞和U87细胞行被选中为后续实验。

过渡委员会监管人类神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和PI3K / AKT信号

过渡委员会mRNA的表达(无花果。2)和蛋白质(无花果。2b)是调节OE-TNC组相比OE-NC组(P< 0.001),而表达下调KD-TNC组相对于KD-NC集团(P在U251细胞< 0.01)。同样,TNC mRNA的表达(P< 0.001)和蛋白质(P< 0.001)增加OE-TNC与OE-NC组(无花果。2c),但降低KD-TNC组相对于KD-NC集团(无花果。2在U87细胞d)。这些结果表明转染成功。进一步的实验表明,过渡委员会积极调控细胞增殖在48 h和72 h post-transfection(无花果。3),但负调节细胞凋亡在U251细胞(图。3(所有b, c)P< 0.05)。此外,细胞增殖是增强72 h post-transfection(无花果。3d),但细胞凋亡(无花果。3e、f)抑制了过渡委员会(所有U87细胞P< 0.05)。此外,PI3K和p-AKT蛋白表达的调节是过渡委员会U251细胞(无花果。4(图a)和U87细胞。4b)。

过渡委员会监管的化学敏感性,具备干细胞在人类神经胶质瘤细胞

随后,U251细胞被选为进一步实验,显示,TNC过度增强细胞内相对可行性处理400 ng / mL, 800 ng / mL和1600 ng / mL紫杉醇,而过渡委员会击倒相对压抑的生存能力在细胞治疗100 ng / mL, 200 ng / mL, 400 ng / mL和800 ng / mL紫杉醇(所有P< 0.05)(图5a)。具备干细胞细胞,过渡委员会提高了球数量每1000个细胞(图。5b)和CD44⁺CD133⁺细胞百分比U251细胞(图。5c, d)(所有P< 0.05)。关于ELDA数据,过渡委员会增加了1 /抑制U251细胞频率(所有P< 0.01)(表1)。

PI3K / AKT信号逆转TNC击倒对细胞功能的影响,在人类神经胶质瘤细胞化学敏感性

在U251细胞,TNC击倒PI3K和p-AKT蛋白表达减少,而治疗740 y p增强PI3K和p-AKT KD-TNC细胞蛋白表达(图。6)。这表明治疗PI3K / AKT激活740 y p U251细胞是成功的。后来,TNC击倒U251细胞中表达下调细胞增殖;然而,740 y p调节细胞增殖KD-TNC U251细胞48 h和72 h(所有P< 0.05)(图6b)。细胞凋亡,这是调节U251细胞的过渡委员会击倒,但下调了740 y p KD-TNC U251细胞(所有P< 0.05)(图6c, d)。

关于化学敏感性,TNC击倒相对抑制U251细胞生存能力;然而,740 y p提拔的相对可行性KD-TNC U251细胞在200 ng / mL, 400 ng / mL - 800 ng / mL紫杉醇治疗(所有P< 0.05)(图7a)。至于具备干细胞细胞,球面每1000个细胞数量减少了TNC击倒在U251细胞,但却增加了740 y p在KD-TNC U251细胞(所有P< 0.05)(图7b)。此外,TNC击倒减少CD44⁺CD133⁺在U251细胞细胞百分比,但740 y p增强CD44⁺CD133⁺(所有细胞百分比KD-TNC U251细胞P< 0.05)(图7c, d)。关于ELDA数据,TNC击倒减少1 /干细胞频率U251细胞(P740 y p = 0.001),而1 /干细胞频率增加KD-TNC U251细胞(P= 0.002)(表2)。

神经胶质瘤是最致命的癌症之一,在世界范围内,5年生存率不到10%的和非常有限的改善治疗。因此仍迫切需要探索新疗法可能在神经胶质瘤患者提高生存(奥斯特罗姆et al。2015年)。此外,诊断神经胶质瘤病例最多只能在一个高级的阶段,也是一个低迷的主要原因神经胶质瘤患者生存的状况。幸运的是,神经胶质瘤的研究进展,其中过渡委员会已经表明承诺,可能在神经胶质瘤病理扮演关键角色。过渡委员会被发现与神经生物学的各个方面,如促进和抑制突触,神经炎症,神经干细胞和神经胶质祖细胞增殖和分化(Gottschling et al。2019年;Wiemann et al。2019年;Faissner et al。2017年)。特别是,一些研究结果表明,过渡委员会可能参与神经胶质瘤发病机理;然而,这些研究结果远非确凿。因此,我们进行了本研究,发现(1)过渡委员会促进神经胶质瘤细胞增殖和具备干细胞而抑制神经胶质瘤细胞凋亡和紫杉醇的化学敏感性;(2)过渡委员会加强PI3K / AKT信号和PI3K / AKT信号激活了过渡委员会对细胞功能的影响和神经胶质瘤细胞中紫杉醇化学敏感性。

基于大量的前研究过渡委员会参与神经胶质瘤的发病机制与多种因素通过互动,主要是导致肿瘤恶化。作为一个例子,一个体外实验发现,大脑肿瘤起源细胞(有限公司)可以减少扩散激活T细胞,尽管这种影响是有限的分泌减少的过渡委员会通过液(Mirzaei et al。2018年)。另一个实验在体内和体外进行报道,TNC击倒增加神经胶质瘤neurosphere细胞粘附和组织的肌动蛋白细胞骨架,表达下调过渡委员会表达在肿瘤微环境与入侵和增强肿瘤细胞的增殖的神经胶质瘤动物模型(夏等。2016年)。此外,一个实验说明interleukin-33 (IL-33)积极监管过渡委员会在神经胶质瘤细胞中表达,和IL-33 / ST2轴增强神经胶质瘤细胞入侵通过组装过渡委员会(Zhang et al。2019年)。除了细胞功能的规定,过渡委员会还参与调节神经胶质瘤血管生成,根据一项研究报告,显示过渡委员会与目标相互作用的Yes-associated蛋白质(笨蛋)双向的方式调节肿瘤血管生成(Rupp et al。2016年)。这些研究表明,过渡委员会作为监管机构调解神经胶质瘤细胞的功能,在神经胶质瘤有限公司和其他相应的细胞。在这项研究中,我们发现,过渡委员会可以提高神经胶质瘤细胞的增殖和具备干细胞,同时减少细胞凋亡和紫杉醇化学敏感性。与先前的研究相比,我们的研究显示神经胶质瘤的更全面的管理角色过渡委员会,这可能源于以下几点:首先,过渡委员会的能力,促进神经胶质瘤细胞恶性活动可能反映了其作为一个重要的细胞粘附的调节器;因此,它可以促进神经胶质瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡通过阻断细胞粘附或与其他组件的交互,如白细胞介素在先前的研究报告(Mirzaei et al。2018年;夏等。2016年;Zhang et al。2019年;Rupp et al。2016年)。这可能也解释了过渡委员会的监管角色具备干细胞在神经胶质瘤细胞和化学敏感性,但还需要进一步的功能实验来证实这一消息。第二,作为我们的后续实验显示,过渡委员会也可以调节神经胶质瘤细胞的功能和化学敏感性紫杉醇通过激活PI3K / AKT信号。

PI3K / AKT信号在癌症研究中被广泛调查作为一种致癌因素,包括在研究神经胶质瘤。举例来说,一个体外实验显示evodiamine诱导胶质瘤细胞凋亡的差别通过调节凋亡蛋白对这些PI3K / AKT信号和增殖kinase-like蛋白质(MAPK)磷酸化(王等。2018年)。另一个glioma-initiating细胞体外研究报告称,镇压PI3K / AKT /机械的雷帕霉素靶(mTOR)信号和声波刺猬信号明显减少细胞生存、更新能力和致瘤的潜在(Nanta et al。2019年)。此外,该信号通路参与了神经胶质瘤化学敏感性。体外研究表明,例如,一个长非编码RNA DNCAR减少顺铂诱导引起的细胞凋亡的信号妳/ PI3K / AKT坏死factor-kappa B (NF-κB)在神经胶质瘤细胞(马等。2018年)。这些发现表明,PI3K / AKT信号是神经胶质瘤发展的催化剂。在目前的研究中,过渡委员会积极监管PI3K / AKT信号在神经胶质瘤细胞,和激活PI3K / AKT信号逆转TNC击倒在细胞功能的影响,包括具备干细胞增殖和紫杉醇的化学敏感性。我们认为,这些结果可能与这一事实有关PI3K / AKT是深入参与神经胶质瘤发病机制的许多方面,以及过渡委员会监管的神经胶质瘤细胞的功能和化学敏感性也需要PI3K / AKT的参与,这是作为PI3K / AKT信号调制的过渡委员会在神经胶质瘤细胞(王et al。2018年;Nanta et al。2019年;马等。2018年)。这些发现提供了一个更深刻的过渡委员会在神经胶质瘤的机械作用,这可能促进进一步的调查可能应用在临床的设置。

总之,过渡委员会作为一个致癌因素通过促进肿瘤细胞增殖和具备干细胞而抑制细胞凋亡和肿瘤药物紫杉醇通过调制PI3K / AKT信号在神经胶质瘤。

生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

这项研究得到了南山区卫生科技计划项目(2019080)。

作者指出

1. 清平,Binchu徐和Fulan胡锦涛了同样的工作。

2. 清华张和你左了同样工作。

从属关系

1. 华中科技大学神经外科学系联合深圳医院,深圳大学第六附属医院健康科学中心(深圳南山人民医院),518056年深圳、广东,中国

   清平,Xianjin陈、刘新民&清华

2. 神经外科学系第七中山大学的附属医院,深圳、广东,中国

   Binchu徐

3. 生物统计学和流行病学、公共卫生学院、深圳大学健康科学中心,518060年深圳、广东,中国

   Fulan胡

4. 南方科技大学神经外科学系盐田医院,518081年深圳,广东、中华人民共和国

   你左

贡献

YZ QHZ构思和设计研究。QPZ和BX收集数据。跳频和XC导致了数据分析。XL进行了实验和起草了手稿。所有作者审查和编辑的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

相应的作者

对应到你左。

相互竞争的利益

作者声明没有潜在的利益冲突的研究,本文的作者和/或出版。

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